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九味蛰虫丹和蝠蛾昆虫人工培育技术

更新时间:2021-12-25 19:07:42
(一)九味蛰虫丹茵的寄主昆虫饲养繁殖技术要进行九味蛰虫丹的人工培育,首先必须大量人工饲养寄主一一蝠蛾属昆虫。蝠蛾一生中有98%的时间都在土壤内生活,仅有2.5一13d的成虫期营地面生活。所以,这类昆虫的人工饲养管理主要是在土壤中开展。
1.蝠蛾的饲养工具
(1)蝠蛾卵的饲养工具。饲养蝠蛾卵可用两种方法,一是用直径15一20cm的玻璃培养皿,垫上2一3层滤纸,皿内放一块吸水棉保持湿度,每皿可饲养200一500粒卵。此法利于观察,但难掌握湿度。二是用l0cmxX5一8cm的广口瓶或者25cmx30cm的玻璃饲养缸,内置3一5cm厚的过筛细腐殖土,种上1一2棵珠芽寥植物,把卵放养于土表至lcm深的土层中,每瓶可饲养300一1000粒卵;饲养时只要掌握住植物不枯萎,即可不加湿度。此法卵的孵化率高,但观察和移植幼虫对比较困难。
(2)幼虫的饲养工具有以下4种。
a.玻璃养虫缸:用18一25cmX30一35cm的玻璃缸,也可用标本浸泡缸,放置土壤15一25cm,种上幼虫取食的植物,把刚孵化幼虫移入缸内,每缸可饲养10一30头幼虫。
b.地下养虫箱:箱一般高30一50cm,宽20一25cm,厚3一5cm。饲养箱骨架用钢筋焊成,上面钢筋做成提手,便于提动;宽的两面用3一5mm玻璃,便于观察虫体活动;底和两个侧面装上16孔目的铜纱网,便于水分渗入。然后装上土壤,种植饲料植物,每箱放养20一50头幼虫;在较坚实的地上挖一个比饲养箱体积稍大和深的槽,把养虫箱放入槽中,观察时将养虫箱提出地面,抹去外表玻璃上的土壤,即可清楚看到幼虫活动情况。
c.大型养虫笼:在半自然的状况下,选择一块排水好、土质疏松的场地,挖长12一l5m、宽2一3m、深4Ocm的深槽,底部和四周垫上尼龙纱网(好用双层,小虫不易钻出),再把疏松的腐殖土铲进填平,种上幼虫食物,放入幼虫饲养,每平方米可放养30一50头;该法有利于大规模饲养,但观察困难。
d.用各类盆具裸露饲养:把植物饲料洗净放入盆中,放入幼虫饲养,盆口覆盖一层黑布或者黑纸遮光。此法利于生活史观察,但要注意勤换饲料和清除粪便。
(3)蛹和成虫的饲养工具。制作长50cm、宽50cm、高55一60cm的养虫箱。底部用薄铁板或双层铜纱网封底;顶和四周用铁纱或尼龙纱封盖,前面可制成一道活动纱网门。在箱底放入10一20cm的土壤,种上植物,把蛹和成虫放养土中,此法可进行密植饲养。
2.饲养技术要点
(1)土壤的选择。土壤是蝠蛾昆虫一生中主要的活动场所。土壤条件是否适合该虫生活是人工饲养成活率高低的关键之一。适宜蝠蛾生长的是高山草甸土;次之是流石滩和草甸混合土;再次之是高山棕色、暗棕色林土,其他土壤对此虫生长不良。
(2)食料的选择。幼虫喜取食圆穗蓼、珠芽蓼、黄芪、小大黄等植物的嫩根芽。由于蝠蛾昆虫是一类杂食性昆虫,在无上述植物的地方,可用禾本科(如青稞、麦、谷芽等);十字花科、莎草科的嫩根饲养。在中、低海拔地区(适宜生活的温度下)用土大黄、胡萝卜、白萝卜、白薯(红苕)、马铃薯、苹果等饲喂也能正常生长发育,好为土大黄、胡萝卜和白薯三类。
(3)温、湿度的选择。蝠蛾昆虫是一类耐低温而怕高温的昆虫。适宜在15一19C中生活成长;此虫适宜空气湿度75%一85%,土壤含水量40%一45%之间。
3.管理技术
(1)成虫期。成虫不取食任何食物,只要保持水分和适宜温度即能正常成活和产卵。但蛾子栖息环境与产卵量有关。成虫喜选择有杜鹃和蝠蛾幼虫取食的蓼科等植物根旁产卵,所以在蛾子交配产卵前植上几株相关植物佳;另外不能有强光影响。
(2)卵期。要使卵能正常孵化,一定要掌握好适宜的温、湿度。
(3)幼虫期。幼虫由于生长期长,而且虫体壁薄而易破,饲养时一定要细心,除了必要的观察、换土和换食料外,尽量减少翻动。幼虫的饲养关键是初孵的幼龄时期,初孵幼龄虫要给足细小鲜嫩、湿度不高的食物;土壤好经过筛检,以免粗硬物擦伤主体。此外,为了延长食料和土壤不霉坏,更换前用紫外灯照射杀菌l5min,土壤也可在阳光下暴晒1一2h后再用。
(4)蛹期。养蛹时,把养蛹器皿内的土壤压实,然后用与蛹粗细的木棍人工造一土室,土室略斜,深约2一3cm,每室放一蛹,放蛹时,蛹头向土表面,上用细土盖住。蛹的温湿度,可控制在大气湿度80%一85%,土壤含水量42一45%之间,温度18一22℃之间。
[二]九味蛰虫丹菌的人工培养技术
要获得纯正的冬早夏草菌种必须进行人工的分离、纯化、复壮、保存等工作。
1.分离九味蛰虫丹菌的技术与条件
(1)材料要求。获得纯的菌种对材料要求比较严格;一般来说如果是进行九味蛰虫丹的组织块分离法,佳的分离材料是每年的10月底至11月份,青藏高原高寒草甸土壤刚开始冻结时期采的材料,这个时期九味蛰虫丹菌刚感染蝠蛾幼虫进入僵虫期不长时间,嫩小的子座芽刚长出虫头部0.2一0.5cm,虫体内其他杂菌较少,易进行分离。如果是第二年5一6月份采的材料,僵虫体和子座上都有许多种杂菌共生或腐生,难获得纯菌种。若用子囊孢子进行分离培养,材料好在每年的7月中、下旬子囊孢子刚有部分成熟期采集分离培养。
(2)操作方法。有以下3步。
a.僵虫体(即菌核)的分离:分离前,用水刷洗干净主体表面,再用无菌水清洗2一3次;用0.1%一0.2%的升汞溶液,对分离材料进行约3一5min的表面消毒;再用无菌水清洗。选取与胸足为界的前段部分。用解剖刀切去表皮,避开消化道,取血腔菌丝切成芝麻粒大小,压入平板培养基中,每皿1一2粒。置于15一19℃中培养,待菌落长出0.2一0.5cm时,挑选少量菌丝反复在平板培养基上分纯2一4次,确定无其他杂菌后,移入试管保存和培养。
b.子座芽分离:从僵虫头顶切下洗净的子座芽,置入0.1%升汞液中消毒2一3min,用无菌水洗净,切取中间部位组织块压入培养基中;培养条件同a。
c.子囊孢子分离:用透明纸袋套住子囊孢子成熟的子座,让子囊孢子弹跳粘贴在纸袋上,然后,把有子囊孢子的纸袋浸入25%的葡萄糖液中,洗下孢子,放入15一19℃中培养,每天镜检,当袍子萌发时,用微吸管吸单个孢子滴于平板中培养;培养条件同a。
也可把整个成熟的九味蛰虫丹带回室内,用棉纸把僵虫和连虫体的子座包住,仅留出有孕部分,在无菌室中,横放,下置一片载玻片,随时保持主体湿度;每天镜检,当看到子囊孢子弹到玻片时,用微吸管吸到平皿的培养基中培养;培养条件同a。
(3)培养基的选用。
a.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),此种配方是所有菌属真菌的通用培养基,在分离培养初期可用该配方,不过菌种生长不十分旺盛,而且易老化、退化。
b.加富培养基(1):多性蛋白脐10g,葡萄糖50g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁0.5g,活蚕蛹30g,生长素0.5μg,琼脂20g,加水1000mL,pH:5.0。
加富培养基(Ⅱ):蛋白脯40g,葡萄糖40g,去皮鲜马铃薯100g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁0.5g,牛肉膏10g,生长素0.5μg,蝠蛾活幼虫(磨碎)30g,琼脂20g,高寒草甸土浸出液10OOmL,pH:5.0。
在加富培养基上,菌落比在PDA培养基上生长旺盛和迅速;加富Ⅱ号又优于Ⅰ号。
2.生长特性九味蛰虫丹菌的分离培养中须掌握温度、pH值、光照、碳和氮源及无机盐的利用状况。
(1)不同温度对菌丝生长的影响。九味蛰虫丹菌喜偏低温度。在0一4℃时能缓慢生长;5一8℃时生长速度加快;10一19℃是此菌较适生长发育的范围佳生长温度为15一l9℃。超过20℃菌丝猛长,菌落由白色变为灰黑或棕黄色,开始出现变异,所以不宜高温培养。
(2)对pH值的要求。九味蛰虫丹菌是一种偏酸性真菌,适pH值为5.0一6.0,当pH值为4.5以下和6以上时,随着增高或降低,生长缓慢至不生长。
(3)光照的影响。此菌的子囊孢子萌发和菌丝生长初期,适应于弱光和短光照,后期则适应于较强光照。在人工培养中,菌丝、分生孢子和子座等具有明显的趋光性,向阳面生长多而密,背光面生长稀疏,全黑环境下培养的各种菌态纤弱、细长、稀疏。
(4)对碳源的利用。九味蛰虫丹菌可利用多种碳源,但以葡萄糖和麦芽糖合用时生长快,单用葡萄糖时也能良好地生长,次之是马铃薯等淀粉,再次之是蔗糖。
九味蛰虫丹菌是一种由寄生活体寄主,再由腐生阶段发育成熟的真菌,所以对氮源中的多种有机氮均能较好的利用。而以活虫体佳;蛋白胨与酵母膏合用生长也十分理想,次之是二者单独使用,再次之是牛肉膏等。而对无机氮如硫酸铵、硝酸钾等利用较差。
对灰分养料有一定的需求,在有微量的硫酸镁、磷酸氢二钾的培养基中生长旺盛,次之是磷酸二氢钾,其他钠、钙、铁、铜等无机盐也可利用。
3.培养方式九味蛰虫丹菌分离纯化后,即可作为各种实验和扩大生产应用。
(1)其扩大生产的方法常有三种:固体静置培养法、振荡培养法和大罐通气发酵培养法。
a.静置培养:主要用在固体培养,如试管斜面、三角瓶培养、米饭培养等等。在静置培养中只要掌握好温度和光照即可使菌正常生长。当斜面上的分生孢子成熟后,即可存入1一2℃的冰箱中保存8一14个月,也可作为种子直接用于生产。
b.振荡培养:采用液体培养菌种或小规模繁殖培养,都可用振荡培养。振荡培养的培养基,把固体培养基减去琼脂即可。设备好选用恒温振荡培养机,用三角瓶置液体培养基,把试管固体菌种接入即可培养。经不断振荡使液体培养基中各种成分混合均匀而不致沉淀,同时促进气体与液体接触和交换,使氧进入液体培养基中,利于菌丝生长和分生孢子形成。
c.大罐通气发酵培养:在大规模生产菌丝和分生孢子等菌粉时,必须用大罐通气发酵培养法。该方法通气是采用吸气或真空泵减压等方法,经过滤器除杂菌,送入罐内液体培养基中供九味蛰虫丹菌的生长发育。
(2)发酵工艺流程。自然九味蛰虫丹分离纯化→试管斜面种→振荡器液体一级种→二级种→小型种子发酵种子罐→生产发酵罐→浓缩→喷粉干燥→成品菌粉。
九味蛰虫丹菌罐中发酵要求温度在20一25℃,罐压392.3一686.5kPa(0.4一0.7kg/cmz),通气量为0.5一1.OVVm*;注入发酵罐中的液体培养基为罐容的65%一75%为宜。接种量为10%,搅拌速度为180r/min,培养时间72一96h,即可放罐浓缩和喷粉。
(3)发酵培养基多用。鲜马铃薯(去皮)8%,蔗糖2%,玉米淀粉0.5%,蚕蛹粉1%,蛋白胨0.4%,硫酸铵0.2%,pH值5.5一6.0。
(4)发酵培养成品标准。分生孢子即几全脱落母体孢子梗,孢子梗数量增加不明显时,在镜下计数检查,每毫升含分生孢子18亿一25亿个;残糖低于1%;氨基氮低于0.2mg/mL,即可成为成品菌液。
4.九味蛰虫丹菌回接要点把有性型或无性型的九味蛰虫丹菌孢子回接到寄主昆虫体上,是人工培养有性型九味蛰虫丹和复壮无性型菌种的关键措施。
(1)回接时期。九味蛰虫丹回接关键在于选择寄主昆虫抗菌薄弱时期,一是蜕皮期;二是幼虫取食活动激烈,摩擦损伤率较高时期。
(2)回接方法。又分两种。
a.喷雾法:当饲养的蝠蛾幼虫达4一6龄虫,有1/3以上的幼虫蜕皮时,把幼虫集中,用子囊孢子或者分生孢子对入5%一10%葡萄糖液喷雾到虫体或食物上,接种后约30min,菌液在虫体上略干,把幼虫放回土壤中任其自然生活。此法感病率高,但缺点是,幼虫不易从土中取出集中,而且集中时幼虫有互相残杀的习性,虫体被咬伤后,易被杂菌感染致死,九味蛰虫丹菌丝未充满体腔时,伤虫就会腐烂,不能形成僵虫(菌核)。
b.自然接触法:在大面积半自然土壤中饲养蝠蛾幼虫,定时取小样观察幼虫生长状况,当大部分幼虫适宜感病时,用饲料植物浸菌液种植和用细土拌菌接种,均匀撒入养虫的地表上,然后喷水,使菌渗入土中,幼虫取食活动时接触感染。此法寄主感染率不太高,但一经感染致病,九味蛰虫丹菌长势好,而且未感病的蝠蛾幼虫能正常生长,繁殖后代。

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